Cas12 활동의 조정 가능한 제어로 보편적이고 빠른 원{1}}팟 핵산 검출을 촉진합니다.
출판사: 중국 과학 기술 대학
저널: 네이처 커뮤니케이션즈
임팩트 팩터: 14.7
MIRA 기술을 사용하여 나트륨 헤파린을 기반으로 한 범용 원{0}}용기 형광 핵산 검출 방법(SURVEY)이 개발되었습니다. 연구에 따르면 나트륨 헤파린은 Cas12a-crRNA 결합 과정을 방해하여 Cas12a 절단 활성을 조절할 수 있습니다. 나트륨 헤파린 농도를 조정함으로써 SURVEY는 기존 PAM 시퀀스와 최적이 아닌 PAM 시퀀스 모두와 호환되며 여러 Cas12 하위 유형에 적용 가능합니다. 이 방법은 검출 시간이 15-20분에 불과하여 원숭이폭스 슈도바이러스, 인플루엔자 A 바이러스 및 SARS-CoV-2를 검출하는 데 95%가 넘는 민감도와 특이도를 달성합니다. 이는 비용이 저렴하고 의료 현장 진단 및 환경 모니터링을 위한 새로운 현장 진단 방법을 제공하여 기존 CRISPR 진단의 민감도와 특이도 간의 어려운 균형을 해결합니다.
1. 헤파린나트륨의 작용기전에 관한 연구
10nM 표적 DNA가 포함된 Cas12a-crRNA 시스템에 형광 프로브를 첨가한 결과, 나트륨 헤파린을 첨가하지 않고도 빠르고 유의미한 형광 신호가 관찰되었습니다. 0.2ug/ml 나트륨 헤파린을 첨가했을 때 형광 신호는 대조군과 유사하여 나트륨 헤파린이 Cas12a의 트랜스{5}}절단 활성을 크게 억제했음을 나타냅니다.. 0.2ug/mL 나트륨 헤파린이 최소 억제 농도입니다. 나트륨 헤파린의 농도가 0.2ug/mL에서 0.5ug/mL로 증가함에 따라 Cas12a의 cis{11}}절단 활성이 점차 억제되고, 0.5ug/mL에서는 trans{14}}절단 활성이 거의 완전히 억제됩니다. 헤파린 나트륨의 작용 메커니즘에 대한 연구에 따르면 음전하를 띤 나트륨 헤파린 그룹이 crRNA와 Cas12a의 올바른 결합을 방해하고 crRNACas12a 이원 복합체의 형성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타났습니다.
- MIRA-Cas12a 원-팟 감지
헤파린 나트륨의 작용 메커니즘을 검증한 후, 이 논문에서는 단일 튜브에서 MIRA 증폭과 Cas12a{4}}매개 형광 검출을 결합한 단일{0}}포트 검출 전략(MIRA-Cas12a)을 탐구했습니다.
나트륨 헤파린이 없는 경우 MIRA-Cas12a 조합은 0.1aM~10fM의 표적 유전자 농도 범위 내에서 유의미한 형광 신호를 생성하지 않았습니다. 40μg/mL의 나트륨 헤파린에서는 1aM(약 0.6개 복사본/μL, 볼륨=30μL)~10fM(약 6,000개 복사본/μL, 볼륨=30μL)의 목표 농도 범위에서 상당한 형광 신호가 관찰되었으며, 이는 나트륨 헤파린이 없는 시스템에 비해 검출 감도가 10,000배 이상 향상된 것으로 나타났습니다.
원숭이폭스 바이러스 주형 농도는 10fM이었으며 Cas12a{2}}crRNA(100nM)를 사용하여 표적 유전자 f31 및 b6r을 검출했습니다. 증폭반응은 0분, 2분, 4분, 6분, 8분, 12분, 16분, 20분에 종료되었으며, 각기 다른 시간에 따른 MIRA 증폭산물 함량을 아가로스 겔에서 분석하였다. 그런 다음 생성된 생성물을 세 가지 다른 설정, 즉 Cas12a가 없는 MIRA-헤파린 나트륨, 헤파린 나트륨이 없는 MIRA-Cas12a, 헤파린 나트륨이 있는 MIRA-Cas12a의 아가로스 겔에서 분석했습니다. 결과는 헤파린 나트륨이 없을 때 Cas12a의 높은 cis{23}}절단 활성으로 인해 핵산 증폭이 방해된다는 것을 보여주었습니다. 그러나 헤파린 나트륨을 첨가하면 Cas12a의 cis{27}}절단 활성이 감소하여 핵산 증폭이 크게 증가했습니다.
이 기사에서는 헤파린 나트륨을 기반으로 한 보편적인 단일 포트 형광 핵산 검출 방법(SURVEY)이 기존 PAM 및 최적이 아닌 PAM 서열을 모두 사용하여 달성될 수 있음을 보여줍니다. 또한 LbCas12a 외에도 AsCas12a 및 AapCas12b도 CRISPR-Dx 방법에 널리 사용됩니다. MIRA-AsCas12a를 사용한 시스템에서는 40ug/mL 나트륨 헤파린 존재에서만 형광이 관찰되어 1fM의 f31 및 b6r 유전자를 검출할 수 있음을 나타냅니다. 나트륨 헤파린이 없는 경우 MIRA-AapCas12b는 1개의 f31 및 b6r 유전자를 감지할 수 있습니다. 20ug/mL 나트륨 헤파린 투여는 MIRA-AapCas12b의 검출 속도를 가속화했을 뿐만 아니라 형광 강도도 향상시켰습니다. 이러한 발견은 나트륨 헤파린 복용량을 사용하여 개발된 원{24}}포트 방법이 다른 Cas12 하위 유형에도 적용 가능하다는 것을 나타냅니다.
