다중효소 등온 급속 증폭 및 측면 흐름 딥스틱 분석을 사용하여 고양이 차파마파보바이러스를 가시적이고 신속하게 검출합니다.
신문:세포 및 감염 미생물학의 개척지
영향력 지수:4.6
고양이 차파마파르보바이러스(FeChPV)는 새로운 파보바이러스로, 2019년 캐나다의 설사 고양이에서 처음 발견되었습니다. 병원성 및 분자적 특성은 아직 불분명하며, 숙주와 유전적 다양성을 보여 추가적인 역학 조사가 필요합니다. 현재 FeChPV 검출을 위한 표준화된 방법은 없습니다.
다중효소 등온 급속 증폭-측면 흐름 딥스틱(MIRA-LFD) 방법다양한 바이러스 탐지에 성공적으로 사용되어 신속성, 단순성, 정밀 기기 불필요 등의 장점을 제공합니다. 연구팀은 풀뿌리 임상 탐지 문제를 해결하기 위해 FeChPV에 적합한 MIRA{1}}LFD 방법을 확립했습니다. 정밀기기에 의존하지 않고,MIRA{0}}LFD 방법은 37도에서 20분 이내에 FeChPV 검출을 완료했으며 다른 바이러스와의 교차 반응은-나타나지 않았습니다. 검출한계는 32.3 Copy/μL 였으며,PCR법보다 10배 높다. 또한 MIRA-LFD 방법은 설사를 하는 고양이 417마리 중 29개의 FeChPV{4}}양성 샘플을 검출했는데, 양성률은 Nested PCR 방법보다 약간 높았습니다. 이러한 결과는 FeChPV를 검출하기 위해 확립된 MIRA-LFD 방법이 효율적이고 경제적이며 신뢰할 수 있고 간단한 방법으로 FeChPV 감염의 조기 예방 및 통제에 기여한다는 것을 나타냅니다.
1. 실험방법
임상 샘플:본 연구에 사용된 직장 면봉 샘플은 2022년부터 2024년까지 광둥성, 허난성, 안후이성, 저장성 및 내몽고 자치구의 동물병원에서 고양이 632마리(설사 417마리, 건강한 고양이 115마리 포함)와 개 474마리(설사 342마리, 건강한 개 132마리 포함)로부터 수집되었습니다.
핵산 증폭:추출된 DNA 핵산을 MIRA 시스템에 추가했습니다. 재조합효소와 프라이머는 복합체를 형성했습니다. 보조 단백질과 단일{1}}결합 단백질의 도움으로 그들은 이중-가닥 DNA 주형을 침범했습니다. 프라이머는 상보적인 영역에 결합하여 D-루프 영역을 형성하고, 재조합효소는 복합체에서 분해됩니다. 중합효소는 프라이머의 3' 말단에 결합되어 DNA 합성을 시작하여 주형의 표적 영역을 기하급수적으로 증폭시킵니다. 이 과정은 빠르고 효율적으로 순환되어 단 15분 만에 표적 조각의 초고속 증폭을 달성했습니다.-
테스트 스트립 색상 개발:핵산증폭산물을 1:10으로 희석하여 테스트 스트립에 도포한 후 5분 후에 결과를 판독하였습니다.
핵산 증폭부터 테스트 스트립 발색까지 전체 과정이 단 20분밖에 걸리지 않았습니다.
Amp-future Biological 제품이 실험에 사용되었습니다.
이 연구에서는 특정 프라이머{0}}프로브 조합의 4가지 디자인 세트를 선별했습니다. 결과 제시에는 아가로스 겔 전기영동과 핵산 테스트 스트립이 모두 사용되었습니다. 4개의 프라이머-프로브 조합 모두 FeChPV 바이러스를 검출할 수 있습니다. 아가로스 겔 전기영동 결과에 따르면 FeChPV-4 조합이 가장 밝은 타겟 밴드를 나타냈으므로 이 조합을 후속 테스트에 선택했습니다.
아가로스 겔 전기영동 결과에 따르면, 5분, 10분, 15분, 20분 동안 증폭하면 모두 목표 밴드가 생성되었습니다. 표적 밴드 강도는 증폭 15분에 최고조에 이르렀으며, 이 분석에 대한 최적의 반응 시간은 15분입니다. 36도, 37도, 38도, 39도 및 40도에서의 증폭은 모두 표적 밴드를 생성했으며, 가장 밝은 밴드는 39도에서 관찰되어 39도를 이 분석에 대한 최적의 반응 온도로 설정했습니다.
(그림 A: 1: 증폭 5분; 2: 증폭 10분; 3: 증폭 15분; 4: 증폭 20분) (그림 B: 1: 증폭 36도; 2: 증폭 37도; 3: 증폭 38도; 4: 증폭 39도; 5: 증폭 40도)
2. 탐지 성능
감광도:
(그림 A: 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 제시된 MIRA 결과)
(그림 B: 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 제시된 중첩 PCR 결과)
(그림 C: 핵산 테스트 스트립을 사용하여 제시된 MIRA 결과)
샘플을 3.23×10⁶ 카피/μL부터 시작하여 10배 연속 희석했습니다. 아가로스 겔 전기영동을 이용한 중첩 PCR은 3.23×10² 복사본/μL을 안정적으로 검출할 수 있었습니다. 아가로스 겔 전기영동을 사용하는 MIRA와 핵산 테스트 스트립을 사용하는 MIRA는 모두 3.23×101 복사본/μL을 안정적으로 검출할 수 있습니다.
MIRA 방법은 서로 다른 두 가지 결과 제시 형식을 사용하여 일관된 민감도를 보였으며, MIRA 방법의 민감도는 Nested PCR보다 우수했습니다.
특성:
(1: FeChPV, 고양이 차파마파르보바이러스; 2: FPV, 고양이 범백혈구 감소증 바이러스; 3: FeAstV, 고양이 아스트로바이러스; 4: FBoV, 고양이 보카바이러스; 5: CachaV, 개 차파르보바이러스; 6: 음성 대조군)
새로 확립된 MIRA-LFD 방법은 FeChPV만 검출했으며 다른 참조 바이러스와의 교차 반응은-보이지 않아 특이성이 우수함을 나타냅니다.
3. 연구 요약
이 연구에서는 고정밀 기기 없이도 FeChPV를 감지할 수 있는 MIRA-LFD 방법을 확립했습니다.- MIRA{3}}LFD 방법은 민감도와 특이도가 높은 효율적이고 경제적이며 신뢰할 수 있는 검출 방법으로 임상 검출에 더 적합하며 FeChPV 감염의 조기 예방 및 제어를 위한 기술 지원을 제공합니다.
4.AMP-미래 생명공학
MIRA 다중효소 등온 급속 핵산 증폭은 -현장에서 신속한 검출을 가능하게 하는 기술입니다.
MIRA 기술은 생체 내 유전자 재조합 복구 메커니즘을 기반으로 하며 실온(25~45도)에서 신속하고(5{5}}20분) 민감하며 특이적이고 안전한 핵산 증폭을 달성하기 위해 실온에서 여러 기능성 단백질의 시너지 작용에 의존합니다. MIRA 기술의 등온 특성으로 인해 장비 요구 사항이 적고 작동이 간단합니다. 소형화된 휴대용 장치를 통해 다양한 애플리케이션 시나리오에 걸쳐 일선 테스트에 적용할 수 있으며, POCT, 가정 테스트, 농업 분야 및 현장 법 집행과 같은 환경에서 신속하고 정확한 핵산 테스트를 제공할 수 있습니다.- MIRA 기술을 기반으로 Amp-future Biotech는 신속 핵산 방출제, 등온 신속 핵산 증폭 시약, 콜로이드 금 테스트 스트립, 소형 휴대용 장비를 포함한 일련의 현장 신속 테스트 제품을 개발하여 현장 신속 분자 테스트를 위한 전체 솔루션을 만들었습니다.- 또한 Amp-future의 MIRA 기술은 CRISPR 기술, NGS, SNP, 미세유체공학 등과 결합할 때 응용 이점을 제공합니다.
위에 표시된 일련의 현장 신속 테스트 제품 외에도 Amp-Future Biotech는 다음을 제공합니다.
연구 시약:기초 과학 연구를 위한 시약 원료 및 기술 지원은 물론 프로젝트 문헌 참고 자료도 제공합니다.
OEM 생산:전체 공정에서 고순도, 고활성 완제품을 독립적으로 생산할 수 있어-산업 규모의-생산이 가능합니다.
프로젝트 위탁 개발:서열 정보 및 서열 정렬 분석 결과, 프로젝트 프라이머-프로브 설계 및 합성, 프로젝트 플라스미드 합성 및 샘플, 프로젝트 보고서 및 결과 등
자세한 내용은 문의를 환영합니다.