《새로운 CAS13A/CAS12A- 매개의 개발"원 포트"듀얼 유전자 변형 작물에 대한 검출 분석
유전자 변형 작물은 전 세계에 널리 심어졌으며, 많은 국가들이 유전자 변형 작물의 안전을 보장하기 위해 규제 조치를 점차 개선했습니다. 빠르고 정확한 현장 유전자 검출 방법의 개발은 농업 및 생물 안전에 매우 중요하며 유전자 변형 제품에 대한 대중의 우려를 완화시킬 수 있습니다.
이 연구에서, 연구 그룹은 유전자 변형 작물에서 CAMV35 및 NOS 유전자 표적의 동시 검출을위한 이중 CRISPR (MR-DCA 방법)과 결합 된 새로운 원 포트 반응 -- miRA 이중 탐지를 개발하여 유전자 변형 된 크로프의 검출을위한 간단하고 효율적인 검출 방법을 제공했다.
실험 방법
MIRA 듀얼 제품은 CAS13A 및 CAS12A 듀얼 시스템에 의해 분석되어 서로 방해하지 않는 두 개의 독립적 인 신호를 생성 한 다음 형광 색상은 조명 기기 또는 두 개의 T 라인을 갖는 테스트 스트립으로 읽어 이중 채널 판독 값을 달성합니다. 전체 프로세스는 35 분 이내에 완료되며, 검출 한도는 20 부로 낮습니다.
(CAMV35 및 NOS의 MR-DCA 탐지 원칙)
전체 실험은 MIRA 증폭, CRISPR 반응 및 결과 해석 방법의 세 단계로 나뉩니다.
CAMV35S 유전자는 CAS13A의 표적으로 사용되며, NOS 유전자는 CAS12A의 표적으로 사용된다. 두 쌍의 미라 프라이머가 각각 설계되었습니다. CAS13A 시스템은 RNA 만 인식하므로 전방 프라이머 영역은 설계되었으며, 이는 CAS13A의 후속 전사 및 활성화를위한 T7 프로모터를 포함합니다. PAM이 NOS 유전자에 추가됩니다. 상기 첨가물은 CAS13A 및 CAS12A 단백질이 각각의 CRRNA에 결합 할 수 있으며, 두 시스템간에 간섭 또는 교차 반응이 없도록 보장한다.
실험 상황
민감도와 특이성
미라 반응의 형광 강도를 시험하기 위해 샘플을 구배로 희석시켰다. 형광 강도는 여전히 20 μL의 샘플 농도에서 검출 될 수 있음이 밝혀졌다. 실험을 위해 20 μL의 농도를 최종적으로 선택 하였다.
(다른 샘플 농도 및 테스트 스트립은 색상 개발 및 강도 정량화 계산에 사용됩니다)
MR-DCA의 특이성을 추가로 평가하기 위해, 연구팀은 비 트랜스 닉 동물 및 비 통증 식물의 혼합 샘플을 테스트했습니다. 결과는 CAMV35 및 NOS를 함유하는 트랜스 제닉 샘플만이 높은 형광 신호를 가졌으며, 다른 샘플의 형광 강도는 음성 대조군의 형광 강도에 가깝다는 것을 보여 주었다. MR-DCA는 특정 듀얼 타겟 핵산 검출 플랫폼으로 사용될 수 있습니다.
24 개의 작물 샘플을 MR-DCA에 의해 테스트 하였다. 그중 1, 2, 15, 16, 21 및 22는 CAMV35S 프로모터를 함유하는 형질 전환 옥수수입니다. 7, 8, 23 및 24는 NOS 터미네이터를 함유하는 질병 내성 형질 전환 쌀입니다. 3, 4, 4, 11, 12, 13, 14, 17 및 18은 CAMV35S 프로모터 및 NOS 터미네이터를 함유하는 형질 전환 콩이다.
(24 개의 샘플 테스트 결과)
빠른 반응
반응 시간은 현장 탐지에서 중요한 요소입니다. 연구팀은 반응 시간이 10 분 일 때 FAM 및 HEX의 형광 신호가 형광기구에 의해 감지 될 수 있음을 관찰했다. CRISPR 반응과 결합 된 MIRA는 또한 15 분 후 황색 형광을 관찰 하였다.
(다른 miRA 반응 시간에서의 형광 신호)
(다른 miRA 반응 시간에서 테스트 스트립 및 강도 정량화 계산의 색상 개발)
실험적인 결론
실험 결과는 이중 miRA가 우수한 특이성을 가지며 CAMV35 및 NOS의 증폭 생성물을 정확하게 얻을 수 있음을 보여 주었다. CAS13A 및 CAS12A 시스템은 서로 방해하지 않고 독립적으로 반응합니다. MR-DCA 테스트는 35 분의 저온에서 20 개의 사본을 정확하게 감지 할 수 있으며, 이는 현장에서 유전자 변형 작물을 탐지하는 데 큰 가치가 있습니다.
기사 정보
저널 이름 : of Journal of Advanced Research Express
기사 제목 : of 유전자 변형 작물 Express에 대한 새로운 CAS13A/CAS12A- 매개 "원 포트"이중 탐지 분석
영향 요인 : 11.4
연구팀 : Wang Xiaofu, Zhejiang Academy of Agriculture Sciences