DNA 폴리머 라제는 분자 생물학에서 중요한 효소이며, DNA 복제 및 복구 과정에서 중심적인 역할을합니다. 실험실에서, DNA 폴리머 라제의 정제는 신중한 계획과 실행이 필요한 세심한 다중 단계 프로세스입니다. DNA 폴리머 라제 공급 업체로서, 나는이 정제 과정의 복잡성에 정통하며, 세부 사항을 당신과 공유하고 싶습니다.
초기 단계 : 세포 성장 및 용해
DNA 폴리머 라제를 정제하는 첫 번째 단계는 종종 효소를 발현하는 세포가 성장하는 것으로 시작합니다. 일반적으로, 대장균과 같은 박테리아는 배양하기 쉽고 빠르게 성장하며 표적 DNA 폴리머 라제를 과발현하기 위해 유전자 조작 될 수 있기 때문에 숙주 세포로 사용됩니다. 박테리아는 전형적으로 온도, pH 및 폭기의 제어 된 조건 하에서 적합한 배양 배지에서 성장된다. 예를 들어, 대장균은 종종 Luria -Bertani (LB) 국물과 같은 풍부한 배지에서 37 ℃에서 배양된다.
세포가 적절한 밀도에 도달하면 원심 분리에 의해 수확됩니다. 이어서, 셀 펠렛을 완충 용액에 재현 탁시킨다. 세포로부터 DNA 폴리머 라제를 방출하기 위해, 용해 단계가 수행된다. 기계적 방법 (예 : 초음파), 화학적 방법 (Triton X -100과 같은 세제 사용) 및 효소 적 방법 (리소자임을 사용하여 박테리아 세포벽을 분해)을 포함한 세포 용해에 대한 몇 가지 방법이 있습니다. 초음파 처리는 효소에 상당한 손상을 일으키지 않고 세포를 효과적으로 방해 할 수 있기 때문에 인기있는 선택입니다. 그러나, DNA 폴리머 라제를 거부 할 수있는 샘플을 가열하는 것을 피하기 위해 신중하게 제어해야합니다.
조잡한 추출물 준비 및 설명
세포 용해 후, 생성 된 혼합물은 단백질, 핵산, 지질 및 세포 파편을 포함한 다양한 세포 성분을 함유한다. 이것은 원유 추출물로 알려져 있습니다. 큰 규모의 잔해물을 제거하기 위해 원유 추출물은 고속으로 원심 분리됩니다. DNA 폴리머 라제를 포함하는 가용성 단백질을 함유하는 상청액은 신중하게 수집된다.
때때로, 조잡한 추출물은 여전히 후속 정제 단계를 방해 할 수있는 상당한 양의 핵산을 함유 할 수있다. 이들 핵산을 제거하기 위해, 폴리에틸렌 이민 (PEI)과 같은 폴리 양이온 성 화합물을 사용하여 침전 단계를 수행 할 수있다. PEI는 음으로 하전 된 핵산에 결합하여 침전물을 유발하여 원심 분리에 의해 제거 될 수있다.
크로마토 그래피 정제
크로마토 그래피는 DNA 폴리머 라제 정제의 초석이다. 서로 다른 분리 원리를 기반으로 사용할 수있는 몇 가지 유형의 크로마토 그래피 기술이 있습니다.
이온 - 교환 크로마토 그래피
이온 - 교환 크로마토 그래피는 종종 정제 과정에서 첫 번째 크로마토 그래피 단계입니다. 순 전하에 따라 단백질을 분리합니다. DNA 폴리머 라제는 주어진 pH에서 특징적인 전하를 가지며, 이들은 양으로 하전 된 (음이온 - 교환) 또는 음으로 하전 된 (양이온 - 교환) 수지에 결합 할 수있다. 예를 들어, DNA 폴리머 라제가 특정 pH에서 순 음전하를 갖는 경우, 디 에틸 아미노 에틸 (DEAE) 셀룰로오스와 같은 음이온 - 교환 수지가 사용될 수있다. 원유 추출물은 컬럼에 로딩되고, DNA 폴리머 라제는 수지에 결합하는 반면, 다른 전하를 갖는 다른 단백질은 통과한다. 결합 된 DNA 폴리머 라제는 완충액에서 염 농도를 증가시킴으로써 용리 될 수있다. 이 방법은 많은 오염 물질을 제거하는 데 효과적이며 샘플에서 DNA 폴리머 라제를 상당히 풍부하게 할 수 있습니다.
친 화성 크로마토 그래피
친 화성 크로마토 그래피는 매우 특이적인 정제 방법이다. 그것은 DNA 폴리머 라제와 수지 상에 고정화 된 리간드 사이의 특정 상호 작용을 활용한다. 일반적인 접근법 중 하나는 HIS- 태그 시스템을 사용하는 것입니다. DNA 폴리머 라제가 유전자 조작 된 경우 히스티딘 태그 (HIS -TAG)를 함유하도록하는 경우, 니켈 - 니트릴 로트 리아 틱산 (NI -NTA) 수지가 사용될 수 있습니다. HIS -TAG는 수지의 니켈 이온에 특이 적으로 결합하여 DNA 폴리머 라제를 컬럼에서 선택적으로 유지할 수있게한다. HIS -TAG가없는 다른 단백질은 컬럼을 통과합니다. 결합 된 DNA 폴리머 라제는 완충제에 이미 다졸을 첨가함으로써 용리 될 수 있으며, 이는 니켈 이온에 결합하기위한 HIS- 태그와 경쟁한다.
사용될 수있는 또 다른 유형의 친화력 크로마토 그래피는 DNA- 친 화성 크로마토 그래피입니다. DNA 폴리머 라제는 DNA에 대한 자연적인 친화력을 가지기 때문에, DNA를 함유하는 수지를 사용할 수있다. DNA 폴리머 라제는 수지상의 DNA에 결합하고, 다른 비 DNA 결합 단백질이 제거된다. 이어서, 결합 된 DNA 폴리머 라제는 염 농도를 증가 시키거나 경쟁자 DNA를 첨가하는 것과 같은 완충 조건을 변경함으로써 용리 될 수있다.
크기 - 배제 크로마토 그래피
크기 - 제외 크로마토 그래피는 겔 - 여과 크로마토 그래피로도 알려진 크로마토 그래피는 크기에 따라 단백질을 분리한다. 기둥은 다공성 구슬로 채워져 있습니다. 작은 단백질은 구슬의 모공에 들어가고 컬럼을 통과하는 경로를 가질 수있는 반면, 더 큰 단백질은 구슬 사이의 공간을 통과하고 조기에 용리합니다. 이 방법은 남은 골재 또는 작은 분자 중량 오염 물질을 제거하는 데 유용합니다. 또한 정제 된 DNA 폴리머 라제의 분자량을 결정하는데 사용될 수있다.
최종 정제 및 품질 관리
크로마토 그래피 단계 후, DNA 폴리머 라제는 일반적으로 고도로 정제된다. 그러나 여전히 약간의 오염 물질이있을 수 있습니다. 소수성 상호 작용 크로마토 그래피 또는 역 상 크로마토 그래피와 같은 최종 연마 단계는 효소를 추가로 정제하기 위해 수행 될 수있다.
정화가 완료되면 엄격한 품질 관리 조치가 필수적입니다. DNA 폴리머 라제의 순도는 나트륨 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS - 페이지)과 같은 기술을 사용하여 평가 될 수있다. 젤의 단일 밴드는 고 순도 샘플을 나타냅니다. DNA 폴리머 라제의 활성은 시험 관내 DNA 합성 분석법을 사용하여 측정 될 수있다. 단백질 단위당 효소 활성의 양인 특정 활성은 정제 된 DNA 폴리머 라제의 품질을 평가하는 중요한 파라미터이다.
기타 관련 효소 및 제품 포트폴리오
우리 회사는 DNA 폴리머 라제 외에도 실험실 연구를위한 다양한 고품질 효소를 제공합니다. 예를 들어, 우리는 있습니다GP41 단백질 2.0DNA 복제 과정에서 중요한 역할을합니다. 다른 제품은엑소 뉴 클레아 제 III 2.0DNA 복구 및 변형 연구에 유용합니다. 그리고 우리SC Reca 2.0상 동성 재조합 및 DNA 복구 메커니즘에 관여합니다.
결론
실험실에서 DNA 폴리머 라제의 정제는 복잡하지만 보람있는 과정이다. 신중한 세포 성장, 용해, 크로마토 그래피 정제 및 품질 관리를 통해, 우리는 매우 순수하고 활성 DNA 폴리머 라제를 얻을 수 있습니다. DNA 폴리머 라제 공급 업체로서, 우리는 과학계의 요구를 충족시키기 위해 최고 품질의 제품을 제공하기 위해 노력하고 있습니다. DNA 폴리머 라제 또는 기타 효소 제품에 관심이 있다면 조달 및 추가 토론을 위해 저희에게 연락하도록 초대합니다. 우리는 항상 연구 프로젝트에 가장 적합한 시약을 갖도록 전문적인 조언과 지원을 제공 할 준비가되어 있습니다.
참조
- Sambrook, J., & Russell, DW (2001). 분자 클로닝 : 실험실 매뉴얼. 콜드 스프링 하버 실험실 언론.
- 스코프, RK (1994). 단백질 정제 : 원리와 실습. Springer- Verlag.
- Deutscher, MP (1990). 단백질 정제에 대한 가이드. 학업 언론.