오늘날 분자 진단 기술은 지난 2 년간 상당한 발전으로 전례없는 속도로 발전하고 있습니다. 그 중에서도 등온 증폭 기술은 특수 장비의 필요없이 증폭을 수행하는 능력으로 인해 더 많은 관심을 끌었습니다. 램프, RPA 및 RAA와 같은 몇몇 잘 알려진 등온 증폭 방법이 존재한다. 그러나 오늘 저는 새로운 등온 증폭 기술 MIRA를 소개하고 싶습니다.
모든 사람이 주요 개념에 대한 일관된 이해를 갖도록하기 위해 다음은 다음과 같습니다.
- 재조합 효소 중합 효소 증폭 (RPA) : 이것은 재조합 효소- 매개 증폭 기술이다.
-RAA (Recombinase-Aided Amplification) : 유사한 재조합 효소-매개 증폭 방법.
- 루프- 매개 등온 증폭 (LAMP) : 또 다른 등온 증폭 기술.
- Multienzyme 등온 빠른 증폭 (miRA) : 새로운 등온 빠른 증폭 기술.
빠른 요약 및 설명 :
많은 사람들이 이러한 다양한 등온 증폭 방법 중 어느 것이 더 신뢰할 수 있고 안정적인지 궁금 할 것입니다. 실제로 모든 기술에는 강점과 한계가 있습니다. 그러나 성공적인 채택의 주요 요인은 다양한 응용 분야에서 생산을 안정적으로 확장하고 저렴한 비용 및 강력한 성능을 확장하는 능력입니다.
이제 내가 알고있는 것에 따라 각 기술을 간단히 분석하겠습니다.
램프 (루프-매개 등온 증폭) :
이 분야의 많은 사람들은 램프가 2000 년에 Notomi 박사가 새로운 유전자 증폭 기술로 개발 한 일본에서 시작했다는 것을 알고 있습니다. 현재이 기술의 소유권은 일본 회사 인 Eiken Chemical Co., Ltd에 속합니다.
장점 :
- 높은 감도 ({2-5 기존 PCR 방법보다 높은 순서).
- 짧은 반응 시간 (반응은 30-60 분으로 완료 될 수 있습니다).
- 임상 사용에 특별한 도구가 필요하지 않습니다 (키트 개발 중에 실시간 탁도계가 권장됨).
- DNA 또는 RNA를 검출하든, 과정은 반응 튜브에서 반응 용액, 효소 및 주형을 혼합 한 다음, 물 욕조 또는 인큐베이터에서 30-60 분에 약 63도 인큐베이션하는 과정이 포함되며,이 과정은 알몸 눈에 의해 관찰 될 수 있음).
단점 :
- 높은 감도는 튜브가 열리면 에어로졸 오염을 초래할 수 있으므로 오 탐지의 위험이 높기 때문에 PCR 실험실 외부에서 사용하기에 적합하지 않습니다.
- 프라이머 디자인은 어려운 일이므로 일부 질병, 특히 일반적인 서열이 거의없는 바이러스로 인한 질병에 부적합합니다.
- 응용 프로그램은 비교적 제한적입니다.
RPA 및 RAA 등온 증폭 기술 :
이 두 가지 방법은 크게 상 동성이며, 주요 차이는 사용 된 재조합 효소의 공급원입니다.
-RPA의 재조합 효소는 T4 박테리오파지에서 나옵니다.
-RAA의 재조합 효소는 박테리아 또는 곰팡이에서 유래 한 것입니다.
작업 원칙의 핵심 사항 :
1. ATP의 존재하에, 재조합 효소는 프라이머에 결합하여 단백질-핵산 복합체를 형성 한 다음, 일치하는 표적 DNA를 검색한다.
프라이머가 일치하는 DNA 주형을 찾으면 ATP 가수 분해는 재조합 효소가 프라이머를 떠나는 에너지를 제공하고, DNA 중합 효소는 새로운 DNA 가닥을 합성한다.
3. 동시에, 단일 가닥 DNA- 결합 단백질 (SSB)은 이중 가닥의 개혁을 방지하기 위해 변위 된 DNA 가닥에 결합한다.
장점 :
-RPA/RAA 반응은 매우 빠르며 결과는 약 30 분 안에 달성 될 수 있습니다.
- 감도는 10 부/μl에 도달 할 수 있습니다.
- 증폭 중에 복잡한 장비가 필요하지 않습니다.
-프로브 기반 또는 콜로이드 금 크로마토 그래피 방법의 추가 개발은 결과 해석을 크게 단순화하여 자원 제한 또는 경제적으로 불리한 지역에 사용하기에 적합합니다.
단점 :
-RPA는 영국 회사 인 TwistDX가 개발 한 기술로 현재 Abbott가 소유하고 있으며 비용이 높고 공급주기가 길고 기술 지원 부족이 발생합니다. 이로 인해 중국에서는 대규모 응용 프로그램과 대량 생산이 어렵습니다.
-RAA는 순전히 국내 기술이지만 간섭 저항 및 제품 시약 일관성 측면에서 안정성이 부족합니다. 또한, 기능성 효소를위한 제조 공정은 개선이 필요하다. 이 기술은 5 년 동안 시장에 나와 있었지만 안정성과 다양성 문제로 인해 아직 널리 채택되지 않았습니다.
-RPA와 RAA 모두 길이가 30-35 bp 인 프라이머가 필요합니다. 짧은 프라이머는 특이성, 감도 및 증폭 속도에 영향을 미쳐 프라이머 설계가 어려워집니다.
MIRA (Multienzyme 등온 빠른 증폭) :
Mira는 중간에 도입 된 새로운 등온 증폭 기술입니다. RPA 및 RAA에 상 동성입니다.
Mira는 작업 원리 측면에서 RPA 및 RAA와 유사성을 공유하지만 효소 선택, 배양, 정제 및 대규모 생산의 다른 측면에는 상당한 차이가 있습니다. 또한 Mira의 개발자 인 Ampfuture의 기술 팀은 거의 11 년 동안 기술을 완성했습니다. 이제 즉시 사용 가능한 시약, 맞춤형 개발, 연구 프로젝트 및 기타 사용자 정의 가능한 서비스 개발을 지원할 수 있도록 완비되었습니다.
장점 :
1. MIRA 시약의 기능성 단백질은 다양한 효소에서 공급되며, 일부 효소는 핵심 효소 시스템의 효율을 향상시키기 위해 표적화 된 변형을 거쳐보다 포괄적 인 시스템을 초래합니다.
2. 강한 간섭 저항 및 안정성. MIRA 시약은 동결 건조 생산 공정과 함께 보조 인자 선택 및 농도 측면에서 광범위한 최적화를 겪어 간섭에 더욱 저항력이 있고 더 안정적입니다.
3. 사용자 정의 및 다양성. 기능성 단백질의 생산 및 기술에 대한 깊은 이해를 완전히 제어하기 때문에 MIRA는 다양한 응용 프로그램에 적응하여 다양한 시약 시스템과 개인화 된 사용자 정의 서비스를 제공 할 수 있습니다.
4. 독점 특허. Mira는 100% 국내에서 개발되었으므로 제품 개발 중에 특허 침해의 위험은 없습니다. 이것은 Mira에게 국내 및 국제 시장 모두에서 경쟁 우위를 제공합니다.
5. 완전한 생산 프로토콜이 확립되어 안정적인 대규모 생산이 가능합니다.
단점 :
1. 시장 인식은 여전히 낮으며, 더 많은 수용을 얻으려면 다른 분야 (예 : 다른 영역의 긍정적 비율)의 더 많은 데이터와 참조가 필요합니다.
2. 프라이머 설계는 여전히 RPA 또는 RAA의 특성을 따르며, 더 긴 프라이머 또는 프로브 시퀀스가 필요하며, 이는 현재 PCR 사용자의 빠른 스위치를 용이하게하지 않을 수 있습니다.